Jakie odczynniki stosuje się w mikroskopii elektronowej?
Mikroskopia elektronowa to coraz bardziej znana i powszechna technika. Stosowana do scharakteryzowania powierzchni, składu chemicznego, struktury materiałów, stopów bądź nanostruktury. Mikroskopia elektronowa umożliwia pomiary rzędu nanometrów (mikroskopia świetlna – mikrometrów).
W zależności od sposobu wykorzystania wiązki elektronów mikroskopy elektronowe dzielimy na:
- transmisyjne (transmisyjny mikroskop elektronowy, TEM, ang. transmission electron microscope),
- emisyjne (skaningowy mikroskop elektronowy, SEM, ang. scanning electron microscope) – obraz tworzy wtórna wiązka elektronów emitowana przez sam preparat.
Etapy przygotowania próbki do badania
Proces przygotowania próbki do badania w transmisyjnym mikroskopie elektronowym wymaga wykonania następujących etapów:
- pobieranie materiału,
- utrwalanie,
- odwadnianie,
- przesycanie żywicą,
- zatapianie w żywicy,
- krojenie ultracienkich skrawków,
- montowanie skrawków na siatki,
- kontrastowanie,
- krojenie ultracienkich skrawków,
- oglądanie preparatów w mikroskopie elektronowym.
Odczynniki do mikroskopii elektronowej
Preparat do badania należy utrwalić w aldehydzie glutarowym lub mieszance aldehydu i formaldehydu, w środowisku buforu kakodylowego. Należy zwrócić uwagę, aby pH utrwalacza było zbliżone do pH tkanki. Specjalistyczne odczynniki, takie jak:
- Aldehyd glutarowy 8%,25 %, 50%, 70% EM Grade;
- Cacodylic acid sodium salt, solution 0,2M, pH7,4;
- Formaldehyde 16% methanol free ultra pure
oferuje firma Polysciences, której wyłącznym dystrybutorem jest UniMarket.
Następnym etapem jest obróbka utrwalonego preparatu za pomocą czterotlenku osmu OsO4, który jest barwnikiem i środkiem kontrastującym. OsO4 dostępny jest w różnych stężeniach i pojemnościach, np. Osmium tetroxide 2% solution, 4% solution, Osmium crystaline 99,95%.
Próbkę po osmowaniu poddajemy odwodnieniu w roztworach alkoholu lub acetonu o wzrastających stężeniach (np. Acetone, glass destiled 99,5%).
Kolejnym etapem jest zatopienie preparatów w żywicy epoksydowej (o wysokiej twardości), z wykorzystaniem kapsułek żelatynowych różnych rozmiarów i kształtów:
- Poly/Bed® 812 Embedding kit,
- Poly/Bed® 812 Embedding kit/ DMP_30,
- Gelatin capsules embedding size 4, size1, size 00.
Po czym krajanie preparatów na skrawki odbywa się przy użyciu noży szklanych lub noża diamentowego (Diamont knife with different lenght blade) w urządzeniach zwanych ultra mikrotomami (Glass ultramicrotome 100x50mmx12). Nóż diamentowy, jest to odpowiednio zeszlifowany i syntetyczny diament, którego zaletą jest bardzo duża trwałość i wysoka jakość uzyskanych skrawków.
Pocięte skrawki o minimalnej grubości, tzw. ultracienkie, nakłada się w precyzyjny sposób na siatki, które są odpowiednikiem szkiełka podstawowego w mikroskopii świetlnej. Zwykle są to siateczki miedziane o średnicy 3 mm ze względu na przystępną cenę w porównaniu z siatkami niklowymi czy złotymi. Siateczki do mikroskopii w różnych rozmiarach i typach oferuje firma Ted Pella, której dystrybutorem jest UniMarket.
Następnie siatki z preparatami przygotowuje się do oglądania w TEM poprzez kontrastowanie octanem uranylu i cytrynianem ołowiu (Lead citrate, powder).
Octan uranylu to produkt sklasyfikowany jako radioaktywny i problematyczny w transporcie i w odpowiedzi na to specjaliści z UniMarket oferują produkt o nazwie Uranyless. Jest on nowym nieradioaktywnym odczynnikiem barwiącym jako alternatywa dla octanu uranylu. Nowo skomponowana mieszanka lantanowca pozwala na szybkie czasy barwienia. Uranyless nadaje się do klasycznych i negatywnych procedur barwienia. Butelka z dozownikiem 30 ml wystarcza do barwienia do 1500 siatek TEM. Zalecany do stosowania z cytrynianem ołowiu.
